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Cell Metabolism:新型策略用于阐明磷脂酰胆碱代谢与整个基因组之间的不确定联系

2023年3月,东京大学等单位的相关研究人员在《Cell Metabolism》(IF: 31.4)上发表了题为“Organelle-selective click labeling coupled with flow cytometry allows pooled CRISPR screening of genes involved in phosphatidylcholine metabolism”的研究论文,开发了一种用于细胞器脂质全基因组筛选的策略,并成功应用于磷脂酰胆碱生物合成与转运相关的基因鉴定。

 亮点概述:

  • 细胞器选择性点击化学与流式细胞术(O-ClickFC)允许对活细胞中多个细胞器的磷脂酰胆碱(PC)进行基于荧光激活细胞分选(FACS)的分析。

  • O-ClickFC可区分PC合成和亚细胞移位缺陷的细胞。

  • O-ClickFC可进行针对细胞器PC表型的全基因组CRISPR筛选。

  • CHEK1、FLVCR1CDC50A被鉴定为人类PC代谢的新关键基因。

 研究背景:

细胞脂质代谢涉及复杂的蛋白质网络,其在时空上调节脂质合成和运输。因此,识别网络中的酶/蛋白质是解开脂质介导的生物过程(如细胞信号传导和细胞器内或细胞器间的膜运输)的分子机制的先决条件。磷脂酰胆碱(PC)是哺乳动物膜中最丰富的磷脂,其代谢异常与多种疾病有关,如癌症、脂肪营养不良等。然而,调控PC丰度和亚细胞分布的全蛋白网络仍然难以捉摸。

最近出现的全基因组CRISPR敲除(KO)筛选有可能为鉴定哺乳动物细胞中的关键遗传因子提供高通量平台。在典型的工作流程中,表现出感兴趣表型的细胞通过细胞活力或荧光激活细胞分选(FACS)进行物理分离,然后进行sgRNA丰度测序(NGS)以鉴定靶基因。当这项技术应用于识别PC调节网络时,需要将PC表型转换为简单的筛选读数。此外,还需要亚细胞水平的空间分辨率用以探索影响细胞器PC分布的关键基因。

研究人员开发了一种策略,将细胞器脂质表型转换成简单的荧光读数,用于全基因组筛选,命名为细胞器选择性点击化学与流式细胞术(O-ClickFC)。首先使用叠氮胆碱(N3-Cho)示踪剂通过内源性途径代谢掺入细胞内PC,再使用细胞器靶向可点击染料(OCD)对N3-PC进行内质网、高尔基体、线粒体和质膜外叶(OPM)的空间选择性标记。最后用流式细胞术测量靶细胞器中荧光标记的脂质,靶细胞器中N3-PC的丰度可以转换为相应OCD的荧光强度。该方法可以很容易地提供局部N3-PC丰度的信息快照,这允许解释表型是由于PC合成的全局异常还是亚细胞转运障碍而发生的。

流式细胞术分析亚细胞PC分布的工作流程

研究人员随后将O-ClickFC应用于全基因组CRISPR-KO筛选,首先关注的是与PC生物合成相关的基因。除了识别到PCYT1A, ACACA等先前报道的相关基因外,研究人员还试图通过关注未知或不清楚其参与PC合成的命中基因来获得新的见解。CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT)是哺乳动物细胞中CDP胆碱途径(主要的PC生物合成途径)的限速酶,抑制CCTα(CCT的主要亚型)可以降低细胞内PC并抑制细胞生长。研究人员发现,检查点激酶1(CHK1)-细胞分裂周期因子25A(CDC25A)-细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)途径通过调节CCTα的C端丝氨酸残基的磷酸化状态来调节CCTα酶活性。此外,FLVCR1是主要促进因子超家族(MFS)的成员,以前被鉴定为质膜血红素输出者,但其与PC代谢相关的功能从未被报道。研究人员发现FLVCR1可促进胆碱的吸收,其缺失显著减少了细胞内内源性胆碱的数量。

CHEK1FLVCR1在PC合成中的作用

随后,研究人员还应用O-ClickFC来鉴定与亚细胞PC运输相关的基因。除了鉴定到已报导的囊泡膜运输(SEC23B, RAB5C)和非囊泡转运(PITPNB, STARD7)相关的基因外,还发现CDC50A(编码磷脂翻转酶)功能的丧失既不影响PC生物合成以及质膜双层的总PC含量,但会下调细胞表面PC含量,影响了PC在质膜双层中的分布。

CDC50A允许PC易位到质膜外小叶(OPM

综上所述,该研究开发了一种针对异质细胞群体的代谢表型方法,用于在单细胞水平上量化磷脂酰胆碱脂质的亚细胞分布。应用O-ClickFC在人类细胞中进行全基因组CRISPR筛选,鉴定了磷脂酰胆碱生物合成及其细胞内运输的已知/新的基因。

 

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