Nature Metabolism：空间分辨代谢组学和同位素示踪揭示齿状颗粒神经元在急性刺激下的动态代谢反应

2023年10月，哈佛大学医学院等单位的相关研究人员在《Nature Metabolism》（IF:20.8）上发表了题为“Spatially resolved metabolomics and isotope  tracing reveal dynamic metabolic responses  of dentate granule neurons with acute  stimulation”的研究论文，通过在脑片上进行质谱（MS）成像，在活细胞生理学和质谱实现的深度化学分析之间架起了一座桥梁。

识别和表征维持神经元功能的代谢途径至关重要，这不仅有助于提高对神经元如何调节其活动和放电频率的理解，还可以为了解疾病状况提供重要信息。鉴于其重要性和临床意义，以及目前对神经元如何代谢支持自身缺乏了解，研究人员试图阐明急性刺激后神经元内调节的不同代谢途径的全面相互作用。

MS，特别是与液相色谱（LC–MS）相结合，是同时测量许多化学物质以及监测同位素标记的燃料分子在均质组织或细胞中特定代谢途径的有利技术。使用MS也可以进行代谢的空间分析——一种方法是基质辅助激光解吸电离MS成像（MALDI–MSI），其中激光和基质用于从完整组织中解吸和电离分子，然后通过MS进行分析。MSI涉及通过在导电玻璃载玻片上冷冻切片来制备整个组织样品，而不是从整个组织的培养或均质化中收集细胞。之后在整个组织中以网格模式获取质谱，产生像素，然后用于生成和分析离子图像。最近的技术进步是将体内注入的稳定同位素示踪剂和MSI相结合，以量化代谢活动的总体区域差异，以及肾切片中的同位素追踪。然而，为了研究对神经元刺激的快速代谢反应，因此需要一种快速保存方法。

为了将急性脑切片制备与MSI相结合，研究人员将含有内嗅皮层和海马体的脑切片浸入具有恒定流量的含氧人工脑脊液（aCSF）的生理室中。由于代谢反应可能具有极快的周转率，因此强有力的代谢淬灭对于确保准确的代谢物测量非常重要。研究人员在生理室的地板上安装了热电装置，实现了代谢反应的即时淬灭。在特定的保温时间内，去除 aCSF，将切片快速热至80 °C 2秒，然后冷却至4 °C; 不久后将切片快速冷冻至 -20 °C。为了进一步制备样品，研究人员将冷冻在热电装置上的脑切片储存在 -80 °C，用于随后在冷冻切片机中进行薄切片。这些薄片被安装在导电玻璃载玻片上用于 MSI制备。数据分析集中在神经元丰富的齿状颗粒（DG）层，用半自动峰采集和代谢物相对定量的方法分析DGC特异性质谱图。通过电刺激诱导下观察到的能量代谢的局部适应，证明了这种方法在捕获代谢物水平的小区域差异方面的可行性。

用于急性脑切片实验、热保存、 MALDI-MSI 和数据分析的工作流程

使用这种方法，研究人员探究了对海马体富含神经元的DGC层刺激的快速代谢反应，发现膜去极化诱导广泛的代谢变化，包括DGCs糖酵解活性的增加，这与刺激诱导更高的能量需求和提高葡萄糖代谢的预期一致。空间分辨的代谢组学表明糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP）有很强的调节作用，但代谢产物水平无法判断通路活性的变化，因为代谢产物水平的增加可能是由生产率的提高或消耗率的降低引起的。

DGC层对刺激的动态代谢适应

为了揭示途径活性的变化，研究人员进一步使用稳定同位素标记的葡萄糖（[U-¹³C₆]-葡萄糖）直接观察供应的燃料掺入下游中间体的情况。发现DGC层的葡萄糖代谢因膜去极化而增加，而PNP的活性进一步促进了PPP，PNP分解肌苷并产生高水平的戊糖磷酸。此外，肌苷是DGCs对刺激的反应而内源性产生的，它可以为下游代谢提供燃料。

碳追踪显示葡萄糖代谢增加，肌苷对刺激的反应增加了PPP

最后，研究人员用癫痫样事件（SLEs）模型探究DGCs中肌苷对戊糖-1-磷酸（R1P）的催化作用，发现代谢反应在不同的神经元活动诱导模式之间是保守的，包括增加糖酵解中间体和肌苷参与R1P催化，以响应DGCs中的KCl刺激和癫痫诱导，且PNP活性维持去极化后DGCs的能量平衡，抑制PNP可导致DGCs从去极化中恢复时能量不足。

PNP活性在SLEs模型中受到调节，并有助于在切片从刺激中恢复时保持细胞能量平衡

总之，该研究通过将海马切片制备和MSI相结合，描述了DGCs对膜去极化的动态代谢适应，并揭示葡萄糖代谢升高伴随着肌苷代谢的调节。