Nature Chemical Biology：刘宇/张丽华/赵群/张鑫合作研发基于小分子的光催化邻近标记方法LipoID，并揭示脂滴-线粒体互作的调控机制
2026年1月，中国科学院大连化学物理研究所、西湖大学等单位的相关研究人员在《Nature Chemical Biology》（IF: 13.7）上发表了题为“LipoID profiles lipid droplet interactions and identifies interorganelle regulators”的研究论文，开发出一种可实现对脂滴相互作用蛋白质组原位表征的邻近标记方法LipoID，揭示线粒体电压依赖性阴离子通道3（VDAC3）通过与脂滴上的蛋白PLIN3相互作用调控脂滴-线粒体邻近关系，并影响脂质代谢。
亮点概述：
- 提出小分子光催化邻近标记技术LipoID，构建X-呋喃-Y骨架的28种靶向探针，筛选出高特异性和高活性氧产生效率的探针B6。
- LipoID成功识别脂质相关蛋白，同时捕获脂滴与细胞器的连接相互作用，尤其凸显脂滴-线粒体的紧密关联。
- 线粒体通道蛋白VDAC3通过与脂滴上的PLIN3相互作用，调控脂滴-线粒体邻近关系。
- VDAC3抑制导致甘油三酯、胆固醇酯等核心脂质成分减少，柠檬酸水平下降，脂质组学分析明确脂滴-线粒体相互作用与脂质代谢重构的因果关联。
研究背景：
脂滴（LDs）是由中性脂质构成的球形细胞内细胞器，外包被单层磷脂和相关蛋白质。其通过与内质网、线粒体、过氧化物酶体等其他细胞器相互作用，参与脂质合成、分解代谢和转运过程。LD功能异常常与代谢疾病相关。因此，对LD形态、相互作用组和脂质组的表征，有助于揭示其在细胞生理调控及相关疾病中的重要作用。然而，LDs的动态特性（尤其是其大小、数量、组成和亚细胞器相互作用的瞬时变化），为捕获这些分子层面的信息带来了技术难题。
为阐明LD相互作用蛋白质组的组成，早期研究采用经典密度梯度离心法，但该技术原则上可能共沉淀内质网、线粒体、内体等相似大小的亚细胞器，导致潜在假阳性结果。后Olzmann等人将APEX2邻近标记技术通过基因标记应用于定位内质网的脂滴蛋白（PLIN）家族（LD生物标志物），但目前仍缺乏简便、无偏倚的工具来研究脂滴蛋白的潜在调控机制。基于小分子探针的光催化蛋白质邻近标记（PPPL）技术，规避了传统基因标记生物标志物带来的技术局限，同时避免了与生物标志物的偏倚相互作用及细胞转染步骤，为LD相互作用蛋白质组的原位从头表征提供了新思路。
借鉴APEX和MiniSOG技术的化学机制，研究人员设计了具有以下特性的化学探针：（1）对细胞LDs的染色选择性；（2）光催化功能（增强活性氧（ROS）产生）；（3）通过ROS介导的底物生物共轭，实现邻近蛋白质的有效标记。研究人员在呋喃骨架两端分别引入4个给电子基团（X=A-D）和7个吸电子基团（Y=0-6），构建了28种X-呋喃-Y骨架探针。随后在AML-12肝细胞中检测了这些探针对LDs的染色选择性，并通过将28种探针的荧光信号与商用LD染料进行共定位分析，发现有17种对LDs具有强靶向选择性。其中，探针B6表现优异，且对内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体等其他细胞器的脱靶效应极小，相对活性氧量子产率显著高于其他探针。其在光照条件下可对LDs邻近的蛋白质进行有效标记，标记效率依赖于光源、脂质体浓度、B6浓度、光照时间和脂肪胺（PA）浓度。
基于小分子的LD相互作用蛋白质光催化邻近标记
为考察B6介导的光化学标记，研究人员首先表征了B6探针产生的ROS种类，发现B6在光照下优先产生I型ROS（・OH和O2・-），而非II型ROS（1O2）。B6通过I型自由基介导的ROS途径实现高效光敏化。基于已报道的酚自由基中间体半衰期（<1 ms）和APEX标记半径（<20 nm），LipoID产生的I型ROS半衰期更短（O2·-≈100 μs，・OH<1 μs），理论标记半径更小。随后，研究人员通过LC-MS/MS鉴定脂蛋白（APOA4）上的氧化中间体和修饰位点，并推导I型ROS介导的标记机制。发现B6主要通过组氨酸残基的氧化和共轭实现修饰。且与APEX特异性修饰酪氨酸、miniSOG化学选择性标记组氨酸不同，LipoID产生的I型ROS自由基可标记组氨酸及其他残基。
LD相互作用蛋白质的光化学邻近标记机制
研究人员利用LipoID标记、富集并表征活AML-12细胞中的LD相互作用蛋白质，并结合LC-MS/MS分析。证实B6可实现LD靶向的光催化邻近标记及LD相互作用蛋白质组的富集。LipoID富集的LD相互作用组中鉴定出163种脂质相关蛋白质，包括LD调控支架蛋白（PLIN2、PLIN3）、LD水解酶（LDAH）和胆固醇合成酶（LSS）。除相关蛋白质外，短寿命ROS的自由扩散帮助鉴定LDs与其他细胞器的相互作用。这些增强的细胞器间相互作用包括线粒体（225种蛋白质）、内质网（149种）、溶酶体（41种）和过氧化物酶体（11种）。其中，LD-线粒体相互作用尤为显著，LipoID富集了大量线粒体蛋白质。以LD-细胞核距离为参照，线粒体与LD的邻近程度显著更高。
LipoID表征LD相互作用蛋白质组及LD-线粒体的连接相互作用
研究人员利用LipoID探索影响LD-线粒体相互作用距离的细胞因子。在饥饿应激（汉克斯平衡盐溶液（HBSS）处理）的条件下，通过LipoID结合比较蛋白质组学，分析LD相互作用组的蛋白质组变化。发现VDAC3蛋白质的丰度显著增加，其作为线粒体孔蛋白，通过调控代谢物和离子的通量，参与细胞能量代谢调控。同时，神经元前体细胞表达的发育下调蛋白4（NEDD4）下调，该蛋白是一种E3泛素连接酶，可调控VDAC3等离子通道的泛素化和降解。这两种差异富集趋势相反的细胞因子表明，VDAC3可能参与LD-线粒体距离的调控。
研究人员进一步评估VDAC3对LD-线粒体相互作用的调控机制。结果显示，通过基因或药物抑制VDAC3后，LD-线粒体平均距离显著增加，还伴随线粒体功能、ATP产生和LD功能的改变。研究人员使用AlphaFold3蛋白质-蛋白质相互作用模型进行预测，发现VDAC3的N端门控α螺旋结构域可能与蛋白质组学鉴定的核心蛋白PLIN3相互作用，推测通过其C端多螺旋结构域的卷曲螺旋相互作用实现，并通过实验验证了细胞内VDAC3与PLIN3的相互作用。
LipoID鉴定出VDAC3为饥饿条件下LD-线粒体相互作用的调控因子
除上述VDAC3-PLIN3分子相互作用外，研究人员还探究了VDAC3抑制导致LD-线粒体相互作用距离增加的原因。发现VDAC3抑制导致细胞ATP水平下降，同时LD-线粒体距离增加。ATP可用性降低还破坏了LD-线粒体-微管的相互作用。研究人员通过寡霉素直接抑制ATP合酶，同样导致LD-线粒体距离增加。这些结果表明，VDAC3对LD-线粒体邻近程度的调控，可能与细胞ATP稳态相关。健康的线粒体膜电位是ATP合成和VDAC介导的ATP输出的关键，二者共同维持细胞能量平衡。研究人员进一步评估线粒体膜电位调控剂通过维持ATP产生，对LD-线粒体相互作用的影响。结果显示，线粒体膜电位调控剂均破坏了LD-线粒体相互作用。综上，VDAC3作为“守门人”，可能通过调控线粒体膜电位、ATP合成和ATP转运功能，维持LD-线粒体的相互作用。
VDAC3通过关联ATP与线粒体膜电位调控LD-线粒体相互作用
研究人员通过高效液相色谱（HPLC）-MS/MS基于的脂质组学分析，比较基础状态、饥饿状态和药物抑制VDAC3处理细胞的脂质谱。结果显示，饥饿状态下多种脂质种类增加，表明细胞通过增强脂质代谢应对短期营养缺乏；而药物抑制VDAC3介导的VDAC急性抑制导致多种脂质类别减少，尤其是甘油三酯（TAGs）和胆固醇酯（CEs），与细胞能量供应降低一致。且VDAC抑制导致细胞柠檬酸水平下降。这可能是由于VDAC通道同时参与柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸等关键代谢物的转运。脂质组学分析表明，VDAC扰动伴随LD-线粒体距离增加，同时影响脂质代谢。
VDAC3抑制使脂质代谢重构
综上，本研究提出一种可直接靶向LDs的光催化蛋白质邻近标记方法LipoID，并使用其鉴定LD-线粒体的连接相互作用，探究了调控LD-线粒体邻近关系的蛋白作用机制及脂质代谢重构。该研究为LD相互作用组的原位表征提供了新工具，并为代谢疾病和癌症相关机制研究提供了新思路与关键靶点。
