Current Biology：季维克团队揭示BLTP2介导的脂质转运驱动外泌体生物发生与肿瘤进展新机制

  研究背景：

多泡体（MVBs）内含有腔内囊泡（ILVs），这些囊泡可被定向运送到溶酶体中进行降解，或作为外泌体释放介导细胞间通讯。MVB中ILVs的生物发生不仅依赖经典的内体分选转运必需复合物（ESCRT）途径，还涉及包含脂质在内的多种协同因子，其中双（单酰基甘油）磷酸，又称溶血双磷脂酸（BMP/LBPA）是一种富集于MVB/晚期内体的非常规磷脂，由线粒体心磷脂途径的中间产物磷脂酰甘油（PG）在晚期内体中转化而来，但具体机制仍不清楚。

在特定的细胞环境中，某些脂质分子的转运主要由膜接触位点（MCSs）处的脂质转运蛋白（LTPs）介导。桥接样LTPs（BLTPs）是一类具有贯穿疏水通道的杆状结构蛋白，可介导净脂质转运，从而为某些细胞器的快速生长奠定基础。BLTP2（又称KIAA0100）是一种新鉴定的BLTP，已知可抑制纤毛发生，并可调节质膜（PM）中磷脂酰乙醇胺（PE）的水平以维持其流动性和功能。然而，BLTP2的细胞功能，特别是其与细胞器生物发生之间的潜在联系仍不明确。

  研究结果：

由于BLTP2是内质网（ER）上的潜在LTP，研究人员推测其功能需要通过伴侣细胞器上的衔接蛋白将其募集至ER相关的MCS。通过免疫共沉淀-质谱（coIP-MS）筛选发现，BLTP2与外泌体相关蛋白存在广泛互作，其中分泌载体膜蛋白SCAMP3显示出最强的相互作用。随后的共定位实验证实，SCAMP3能够有效将BLTP2招募至ER MCSs，因此，将研究重点聚焦于SCAMP3。免疫荧光（IF）和体外谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验表明BLTP2与SCAMP3存在直接且特异性的相互作用，且该结合具有区室特异性（主要在内体而非高尔基体）和动态调控性。在小鼠肾脏组织裂解液中，内源性SCAMP3可特异性共沉淀BLTP2与小GTP酶Rab5A，而不结合线粒体蛋白TOM20或高尔基体蛋白GM130，在生理条件下验证了该相互作用的特异性。超分辨结构照明显微镜（SIM）与原位邻近连接实验（PLA）进一步定位显示，约60%的内源性BLTP2点状结构分布于ER与SCAMP3标记的内体交界处，表明BLTP2在形成或维持ER-内体膜接触结构中发挥重要作用。

接下来，研究人员通过高分辨率活细胞成像技术检测了BLTP2-SCAMP3相互作用是否介导了ER-内体MCS的形成，发现共表达SCAMP3后BLTP2被高效募集至ER与SCAMP3阳性内体相邻的位点，且该招募具有特异性。此外，Split-GFP互补实验显示信号特异性出现在ER包裹的内体处，证实了SCAMP3是将BLTP2招募至ER-MVB MCSs的关键衔接蛋白。

BLTP2与SCAMP3在ER-内体MCSs处发生相互作用

由于SCAMP3与Rab5A共沉淀，研究人员探究了Rab5A活性是否调控BLTP2的招募。发现内源性BLTP2和SCAMP3的点状结构与野生型GFP-Rab5A共定位，而显性负性突变体Rab5A-S34N则消除了这种关联，并导致Rab5A内体上的BLTP2点状结构消失。组成型活性突变体Rab5A-Q79L可增大内体体积，增强BLTP2与SCAMP3的共定位，表明SCAMP3介导的BLTP2募集受Rab5A的调控。同时，SCAMP3 siRNA敲低会显著削弱Rab5A驱动的BLTP2募集及两者间的相互作用。这充分证明，由Rab5A驱动的BLTP2募集严格依赖于SCAMP3。

随后，研究人员通过构建突变体等实验，鉴定了BLTP2蛋白C端区域中一个含带电残基簇的α螺旋-连接模块，该模块是BLTP2与SCAMP3结合的关键区域，其中带电残基对二者的相互作用至关重要。体外GST下拉实验显示，BLTP2的C端与SCAMP3的N端之间存在直接相互作用。AlphaFold预测了SCAMP3 N端80-120位残基形成的、面向胞质的α螺旋直接与BLTP2 C端（残基1703-2235）的α螺旋相互作用。此外，SCAMP1、SCAMP2和SCAMP4均可招募BLTP2，而神经元特异性的SCAMP5不能；coIP显示SCAMP1-4结合BLTP2、SCAMP5不结合，其中以SCAMP3最强。SCAMP1-3共有一段该相互作用所必需的保守N端片段，而SCAMP4缺少该片段，其纯化的N端（1-39位）不与GST-BLTP2-CT结合，提示SCAMP4为间接结合。因此SCAMP家族成员部分冗余，SCAMP3是主要的衔接蛋白。这一募集过程受到NEDD4介导的SCAMP3泛素化作用的抑制。

SCAMP3对BLTP2的招募依赖于Rab5的活性

基于SCAMP3将BLTP2招募至ER-MVB的发现，研究人员系统探究了BLTP2在MVB/外泌体生物发生中的功能。通过蛋白质组学、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和活细胞成像等多种实验手段证明，BLTP2敲除（KO）显著减少外泌体数量及外泌体标志蛋白（如TSG101、CD81、CD9、CD63、SCAMP3及EGFR）含量，表明BLTP2是高效形成ILV/外泌体所必需的。虽然BLTP2缺失也轻度影响溶酶体降解通路，但整体数据表明BLTP2优先参与外泌体货物分选，而BLTP2-SCAMP3相互作用标志着一种专司外泌体分泌的独特MVB亚群。通过构建脂质转运缺陷型突变体和SCAMP3结合缺陷型突变体，发现两者均无法挽救BLTP2-KO细胞的外泌体分泌缺陷，说明BLTP2通过其脂质转移活性以及在ER-MVB接触点处与SCAMP3的相互作用共同支持ILV/外泌体的生物发生。

BLTP2的缺失损害外泌体/ILVs的形成

为鉴定被转运的脂质种类，研究人员在HEK293细胞中对BLTP2-GFP进行了coIP，并结合非靶向脂质组学进行分析，发现BLTP2偏好结合PG，它是MVB富集脂质BMP/LBPA的前体。锥形脂质，如PE、甘油二酯（DAG）、神经酰胺、胆固醇和BMP/LBPA，能够在ILV形成过程中促进膜的负曲率，因此BLTP2可能通过转运这些脂质来促进膜内陷。研究人员从对照组和BLTP2-KO细胞中分离了内体和ER膜并进行靶向脂质组学分析。在内体中，KO细胞的PG、BMP/LBPA和PE含量显著降低，其中PG和BMP/LBPA的降幅大于PE，而磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酸（PA）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）基本未发生变化；而ER中多种脂质也受不同程度影响，提示BLTP2的缺失广泛影响了ER的脂质稳态。由于PG也是线粒体主要磷脂和心磷脂的必需前体，研究人员探究了BLTP2缺失是否会扰乱线粒体脂质组。结果显示，KO细胞中线粒体PG减少约44%（PE轻度升高），但心磷脂基本保留。这被认为是细胞对BLTP2依赖性PG流量受损的系统性代偿——细胞下调PG合成而非任其累积——而非线粒体本身受损，因此ILV/外泌体缺陷非继发于线粒体损伤。IF进一步证实BLTP2-KO细胞中，BMP/LBPA形成内体腔内的点状信号几乎消失。综上，BLTP2特异性调控内体中的PG、BMP/LBPA和PE，以支持ILV的形成。

最后，研究人员揭示了BLTP2依赖性外泌体生物发生与细胞增殖、肿瘤生长及肿瘤血管化之间的关联。BLTP2-KO导致HeLa细胞增殖下降，且可被纯化的野生型外泌体剂量依赖性地部分挽救；在4T1同基因移植小鼠模型中，接种BLTP2敲低细胞的小鼠有70%完全不成瘤，其余成瘤者瘤体也明显小于对照；CD31免疫组化显示敲低组瘤内毛细血管显著减少，且可被外泌体回补部分恢复。

BLTP2的缺失降低了内体中PE、PG和BMP/LBPA的水平

总之，该研究表明，SCAMP3将ER锚定的脂质转运蛋白BLTP2招募至受Rab5调控的ER-MVB接触位点；在这些位点上，BLTP2参与维持PG/BMP的稳态、调控ILVs与外泌体的生物发生，以及促进肿瘤生长与肿瘤血管化。