新方法: 利用双链标记快速亲和纯化胞内细胞器

真核细胞内有着不同膜封闭的细胞器，每个细胞器携带数百到数千种蛋白质、脂质和代谢物，并执行一套独特的细胞功能。例如，溶酶体是主要负责清除细胞内不必要物质的降解区；线粒体是支持细胞合成途径产生ATP的主要细胞器；过氧化物酶体是分解长链脂肪酸和调节氧化平衡的主要囊泡。除了它们众所周知的经典功能外，最近的研究也揭示了一些细胞器直接参与细胞信号传递。例如，雷帕霉素复合物1 (mTORC1)的机制靶点被募集到溶酶体表面，并通过感知腔内营养物质(如氨基酸和胆固醇)的丰富程度而被激活。同样，线粒体也可以作为信号细胞器。例如，线粒体释放的细胞色素C会导致细胞死亡。然而，当前普遍的生物医学研究并没有提供细胞器的空间信息，因此无法解释不同的细胞器如何调节其细胞功能。所以，测量特定细胞器的组成和其对刺激反应的变化能力，将为了解这些细胞器的功能提供重要信息。

传统上，分离不同的亚细胞器会采用差速离心或多步密度梯度超速离心的方法。然而，大多数亚细胞分离方法都有一些固有的缺点。例如，分离不纯；浓度通常较低，使一些下游分析具有挑战性；耗时较长，这可能导致细胞器的组成（特别是细胞器的胞质小叶上的信号分子和一些不稳定的小分子代谢物）发生变化。除了上述的传统分离方法外，还有一些其它特定的方法来纯化某些细胞器。例如，溶酶体被氧化铁结合的葡聚糖负载后可被磁体分离，这可能会造成不可降解的葡聚糖的长期积累，会对溶酶体功能产生一些意想不到的影响。最近也有一些研究表明，使用与内源性线粒体或溶酶体蛋白抗体偶联的珠子，或者是针对与这些常驻蛋白融合的表位标签，可以成功地纯化线粒体和溶酶体。虽然抗体亲和纯化快速特异，克服了传统方法的一些缺点。然而，抗体亲和纯化需要大量的抗体，并且功能性细胞器的洗脱效率也不高。

2019年12月，美国德克萨斯大学休斯顿健康科学中心的相关研究人员在《Journal of Cell Science》上发表了题为“利用双链标记快速亲和纯化胞内细胞器”的研究论文，阐述了一种利用双链球菌标记和链霉亲和素变体之间的极高亲和力来快速分离细胞内细胞器的方法，为研究细胞内细胞器的时空调控和功能提供了强有力的工具。

一种流行的蛋白质纯化策略是将感兴趣的蛋白质与链球菌II标记（WSHPQFEK）融合，这模拟了生物素和链球菌亲和素之间的强相互作用。低浓度的生物素衍生物可以有效地洗脱带有链球菌II标记的蛋白质。链球菌II标签具有生物学惰性，标记的蛋白质和链霉亲和素磁珠之间的结合可以在生理条件下进行。除了蛋白质纯化外，这种容易可逆的相互作用还允许使用链球菌II标记来纯化活的抗原特异性T细胞。最近产生的Strep-Tactin XT链霉亲和素变体，进一步增加了两个串联链球菌标签之间的亲和力。与大多数商业表位抗体(如FLAG、Myc和HA双链球菌标记)的微摩尔-纳米摩尔解离常数(Kd)相比，双链球菌标记具有纳米级到微克级的解离常数(Kd)，同时保持了结合的可逆性。此外，链霉亲和素比抗体稳定得多，因为它可以抵抗几乎所有的蛋白酶和极端的pH值，这有助于减少珠子的浪费，并获得一致的结果。

研究人员以溶酶体为例，利用双链球菌标记设计一种新的亲和溶酶体纯化方法。将双链球菌标签融合到mGFP-LAMP1（溶酶体蛋白）的C末端(Lyso-2Strep)（图1A)。细胞质内孪生链球菌允许随后使用链霉亲和素磁珠纯化溶酶体（图1B)。所有的溶酶体膜蛋白都是在粗面内质网上合成并运输到反式高尔基体，然后运输到溶酶体。Lyso-2Strep的表达受一个四环素诱导的启动子控制，该启动子可在溶酶体分离前几小时关闭转录。同时诱导性启动子的加入可控制Lyso-2S trep的表达水平，从而最大程度地减少外源性Lyso-2S trep过表达。研究人员构建了稳定表达Lyso-2Strep的HeLa细胞系，同时检测 Lyso-2Strep正确定位于溶酶体，并与溶酶体标记物LAMP2共定位(图1C)。这表明添加双链霉菌标记不会干扰LAMP1和Lyso-2Strep的溶酶体靶向，可以用于溶酶体的亲和纯化。

图1：Lyso-2Strep亲和纯化溶酶体的设计

通常纯化蛋白常用珠子的直径是25um。研究人员认为珠子的大小可能会影响与溶酶体的结合能力，因此测试了50nm、1um、5um和25um不同直径的链霉亲和素磁珠。发现只有直径为1um的珠子能回收大部分溶酶体（图2A)。为了检测分离出的溶酶体的纯度，研究人员对几种细胞器标记物蛋白水平进行Western blot分析。结果显示：检测到溶酶体（LAMP1和LAMP2），但不检测线粒体(SDHA和TOM20)、内质网(SERCA和PDI)、高尔基体(Golgin-97和GOLM1)、过氧化物酶体(过氧化氢酶和SLC27A2)、质膜(PMCA2和ATP1A1)和胞浆(S6K和ERK1/2）(图2C)，表明没有其它细胞器污染。为了检测纯化后的溶酶体是否完整，研究人员使用LysoTracker（选择性地标记酸性细胞器）染色，绝大大多数纯化的溶酶体被LysoTracker标记，表明它们保持完整并保持低腔内pH值(图2D)。接下来，研究人员分析了孵育时间和链霉亲和素磁珠的数量如何影响溶酶体的回收效率。100ul的PNS中加入30ul的珠子孵育2min，得到60%的溶酶体含量(图2E)。接下来将孵育时间延长至30min，溶酶体的含量并没有明显的增加(图2E)，表明珠子的结合能力很快接近饱和。将珠子的量调高到60ul，时间缩短到30S内，可得到60-70%的溶酶体含量(图2E)。整个分离过程包括细胞收集和匀浆(＜5min)、孵育(0.5min)和清洗(2min)，可以在不到8min内完成(图1B)。这些结果表明，Lyso-2Strep允许极快地分离溶酶体，这一特性对溶酶体表面结合的蛋白质和溶酶体腔中的小分子代谢物等分析极为关键。

图2：溶酶体纯化关键因素的测定

最近的研究表明，溶酶体表面可以作为一些重要信号通路的平台，如mTORC1和TFEB。mTORC1是细胞代谢的主要调控因子，已被证实在溶酶体表面被瞬时激活，以应对细胞内营养物质(如氨基酸)水平的增加。由于营养调节的mTORC1与溶酶体的关联是短暂的，只涉及总细胞的一小部分。接下来，研究人员测试了由Lyso-2Strep纯化的溶酶体是否能够捕获在正常、氨基酸剥夺和氨基酸剥夺/补充生长培养基中培养的HeLa细胞中溶酶体上mTORC1复合物的变化。结果发现，与mTORC1组分溶酶体关联的变化相一致，mTORC1在Ser2448位点的磷酸化水平(表明mTORC1在分离的溶酶体上是激活状态)在1小时氨基酸饥饿后也下降了60%。同样，mTOR磷酸化的减少也通过补充氨基酸得以恢复（图3）。

图3：利用Lyso-2Strep分离的溶酶体，证实mTORC1在溶酶体上的激活

溶酶体的快速分离使分析溶酶体腔内的代谢活动和代谢物成为可能。溶酶体直接参与蛋白质、氨基酸等大分子的代谢。胞浆中的代谢活性受溶酶体腔内氨基酸水平的调节，研究人员用质谱法测量了分离的溶酶体中不同氨基酸的水平，并将它们与胞质中的氨基酸进行了比较。结果显示，半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸和缬氨酸在溶酶体中所占的比例明显高于胞质，而含量第二丰富的氨基酸苯丙氨酸在胞质的含量是溶酶体的2倍。所有其他氨基酸在胞质和溶酶体中所占比例相似（图4）。

图4：液相色谱-质谱法测定胞质和溶酶体中氨基酸含量

综上所述，该方法可以快速有效地分离完整的溶酶体、线粒体和过氧化物酶体，并且纯化出的溶酶体可用于分析信号动力学和代谢物。同时，该方法也可能适用于从其它哺乳动物组织或非哺乳动物细胞或组织（如、植物、线虫或果蝇）中快速分离特定的细胞器群体。