Cell：解密细胞膜不对称：胆固醇如何维持膜结构的稳定？

• 哺乳动物质膜的两个叶层的脂质丰度可能存在差异。

• 高胆固醇水平可以稳定磷脂丰度不对称。

• 磷脂和胆固醇不对称分布赋予膜独特性。

• 细胞胆固醇稳态受磷脂不对称性调节。

 研究背景：

真核生物细胞质膜（PM）的一个显著特征是其组成的不对称性，即双层脂质叶的磷脂（PL）组成显著不同。这种不对称性由ATP驱动的酶建立并维持，这些酶能够定向翻转双层。通过调控该过程产生了具有不同组成和物理性质的叶层，包括相对紧密排列的外质叶层（外层）与高电荷、高流动性的细胞质叶层（内层）。胆固醇（Chol）作为主要的PM成分，其在膜两叶层间的分布情况仍存争议。尽管不同生物体和细胞类型之间的脂质组成存在差异，但跨膜蛋白结构域的共性表明大多数真核生物PM是不对称的。

PM不对称性与多种细胞功能相关，其中最显著的是细胞凋亡，在此过程中细胞质叶层脂质磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面的暴露是其核心特征。尽管有大量证据表明PM双分子层存在明显的化学和物理不对称性，但目前尚不清楚为什么大多数细胞需消耗大量代谢资源来维持远离对称平衡的膜脂分布状态。

研究人员首先通过外质叶层脂质的酶解与质谱法量化了人类红细胞PM中几乎所有PL类别的分子组成不对称性。显示糖鞘脂（GSLs）占外质叶层脂质的15mol %，而Chol占PM脂质的40（±1）mol %。随后研究人员比较了两个PM叶层之间的总PL丰度。结果发现细胞质叶层PLs的含量是外质叶层的1.4-2.2倍。

红细胞PMs的外质叶层PL含量较少

为了研究先前被忽视的具有广泛PL丰度不平衡的膜的可行性，研究人员基于脂质组学数据构建了PM模型，该模型的细胞质叶层相对于外质叶层中具有更多的PLs，命名为Cyto+，并得到假设Chol可以在PL含量低的叶层中富集，从而促成两层膜间PL的显著不平衡。研究人员进行了一系列模拟计算验证该假说，其中固定了PL膜层不平衡（细胞质叶层中的PL比外质叶层多35%）和Chol含量从10到50 mol %不等变化。在PL不平衡的情况下，低浓度的Chol无法维持稳定平坦的双层膜形态，相比之下，含有30mol % Chol的膜能够形成稳定平坦的双层膜，证实了Chol在足够丰富的条件下通过其不对称的叶间分布，使PM耐受较大的PL不平衡。研究人员进一步在细胞实验中进行验证，结果表明，当Chol被提取时，PL会在PM两个叶层间重新分布以维持膜完整性。若该机制被抑制，膜完整性将丧失，证实了Chol赋予活细胞中叶层间PL丰度失衡的耐受性的观点。

Chol赋予双层叶之间PL丰度不平衡的耐受性

在Cyto+模型中，研究人员发现，Chol通过在外质叶层中的积累来平衡细胞质叶层中过量的PLs。PM中的PL失衡可以通过翻转酶的酶活性来建立，这些酶利用ATP逆浓度梯度将氨基磷脂（PS和磷脂酰乙醇胺（PE））从外质叶层转移到细胞质叶层。当越来越多的PS被翻转至"内层"时，膜应力显著增加。研究人员还发现Chol被动地“翻转”到外质叶层可以减轻由此产生的应力，这与先前关于快速翻转脂质缓冲叶层张力的研究结论一致。除了这种缓冲压力的作用外，Chol优先与饱和脂质相互作用，特别是PM外叶层中特有的饱和鞘磷脂（SMs）。这些发现揭示了Chol对某些脂类（饱和脂类、鞘脂类）的偏好与其倾向于填充在PL稀疏的膜层的特性相结合，决定了其最终的跨膜分布。脂质组学检测结果显示，红细胞PM外质叶层更饱和，富含鞘脂，而PL含量较少，这强烈预示Chol会在其中富集。接下来研究人员评估了活细胞PM中Chol分布，结果表明Chol富集于人红细胞PMs的外质叶层中。研究人员随后通过对多种细胞测量验证了Cyto+模型PM的组成、结构和动力学特征。

Chol在Cyto+模型和活细胞膜上的叶层间分布

研究人员进一步探究了这种非常规脂质组织对膜生物物理性质的影响。大量的脂质不对称性表明膜中存在应力，研究人员首先计算了每个膜层的横向压力分布。虽然双层膜没有净应力，但外层膜受到压缩，而细胞质层膜则承受相同大小的张力。这种在整体无张力膜中平衡的压缩力/张力被称为"差异应力"。在Cyto+模型中，差异应力既来自于膜层间PL含量的差异，也来自于Chol对外层膜的偏好，破坏脂质不对称性会消除这种应力差异。根据其显著的脂质压缩，研究人员通过计算模拟和实验验证了富含Chol的外层膜可能构成跨膜通透性的稳固屏障。在Cyto+模型中，细胞质叶层的低脂质密度、高静息张力和高渗透性表明可能频繁出现疏水缺陷，即疏水双层膜核心暂时暴露于水的区域。此类缺陷先前已被认为是周边蛋白质通过疏水部分与膜相互作用的"结合位点"。研究人员分析预测，Cyto+膜的结构通过促进疏水锚的插入，有助于周边蛋白质与细胞质叶层的结合并在活细胞中进行了验证。

Cyto+模型的生物物理特征

为了探究脂质分布不对称性的生理影响，研究人员假设，由于细胞Chol感知与转运机制主要位于细胞质中，因此只有细胞质叶层膜中的Chol参与这些过程。于是，研究人员通过调控外质叶层SM和双分子层PL丰度两个决定因素验证这一假设，结果表明细胞内的Chol感知、稳态和储存机制可以在不改变Chol水平的情况下被激活，而是通过Chol在膜两侧的分布来调节，而这种分布受PM膜层的PL组成和丰度调节。

总之，该研究整合细胞学、生物化学与计算模拟方法，阐明了细胞膜不对称性中一个很大程度上被忽视的结构和功能特征：PM膜层之间存在显著的稳态PL丰度不平衡。这种失衡通过Chol的不对称分布实现，Chol能够快速跨层重分布以缓冲膜层应力。这种出人意料的PL和Chol分布模式赋予生物膜独特特性，揭示了PM不对称性及其调控释放的功能作用。