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Science Bulletin: 黄勋团队揭示Cds2调节线粒体磷脂含量和线粒体功能影响NASH的快速发生

2021年10月，中科院遗传与发育生物学研究所等单位的相关研究人员在《Science Bulletin》（IF: 11.8）上发表了题为“Hepatic CDP-diacylglycerol synthase 2 deficiency causes mitochondrial dysfunction and promotes rapid progression of NASH and fibrosis”的研究论文，揭示了小鼠肝脏 Cds2 对非酒精性脂肪性肝炎发生的影响及相关机制。

亮点概述：

  • 肝脏特异敲除 CDP-二酰基甘油合成酶-2（Cds2）小鼠快速产生肝脏脂肪大量储积、肝炎和肝纤维化等一系列肝脏病变。

  • 敲除 Cds2 会导致线粒体功能受损和线粒体磷脂酰乙醇胺含量下降。

  • 肝脏过表达线粒体磷脂酰乙醇胺合成酶（Pisd）会增加线粒体磷脂酰乙醇胺含量，并减轻了肝脏 Cds2 敲除小鼠肝损伤的表型。

  • 过表达 Cds2 可以抵抗高脂喂食诱导的脂肪肝和肥胖。

研究背景：
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括一系列肝损伤，从脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，后者可发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。目前常用的遗传小鼠模型，如db/db（瘦素受体基因自发突变纯合子）小鼠等不会自发进展到NASH和肝纤维化等较为严重肝损伤，除非存在继发性饮食或化学肝毒性损伤。因此，创造严重疾病表型（如纤维化和HCC）快速进展的遗传模型，可能对理解该疾病的机制以及评估抗NASH和抗纤维化候选药物的治疗潜力大有裨益。
在NASH患者中经常检测到线粒体功能障碍，这对于从简单的脂肪变性转变为NASH很重要。磷脂影响线粒体功能，尽管其合成主要发生在内质网（ER）中，但线粒体能够合成磷脂酸（PA）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和心磷脂（CL）。此外，线粒体还通过ER-线粒体膜接触，特别是通过线粒体相关膜（MAMs），从ER获取其他磷脂，如磷脂酰丝氨酸（PS）。PS从ER运输到线粒体，并在PS脱羧酶（PISD）的帮助下脱羧，以在线粒体中合成PE。除了内质网-线粒体脂质交换外，MAMs还参与多种细胞过程，如Ca2+信号传导、凋亡、自噬和炎症反应。MAM蛋白调节代谢过程，如脂肪酸分解代谢、胆固醇和磷脂生物合成。然而，在NAFLD进展的背景下，MAM蛋白在调节脂质代谢中的作用尚未确定。
CDP-二酰基甘油（CDP-DAG）合酶（CDS）催化PA转化为CDP-DAG，随后在哺乳动物中用于合成磷脂酰肌醇（PI）和PG。哺乳动物细胞有两种CDP-DAG合成酶，分别为CDS1和CDS2。小鼠Cds1和Cds2具有不同的组织分布。Cds1在大脑中高表达，在肝脏中低表达。Cds2在大脑中高表达，在其他组织中普遍表达。CDS1和2定位于ER中，具有细微但明显不同的分布。在线粒体中，CDS活性也由线粒体内膜酶提供。以往研究发现CDS影响线粒体形态，然而，CDS如何影响线粒体形态尚不清楚。

线粒体功能对肝功能至关重要。临床证据表明，线粒体脂质成分可能会影响肝功能。在西方饮食诱导的小鼠NAFLD过程中，线粒体磷脂酰胆碱 (PC)、PE 和 PS 水平降低。线粒体PC-PE比率与肝细胞中的细胞ATP水平呈负相关。然而，线粒体磷脂成分的改变是否是NAFLD的病因尚不清楚，线粒体磷脂在纤维化等晚期肝病发病机制中的作用尚不清楚。


研究人员首先测试了CDS2在NAFLD中的参与，发现CDS2在遗传和饮食诱导的NAFLD小鼠模型中被下调。为了探究其在NAFLD发病机制中的作用，研究人员构建了肝脏特异敲除Cds2小鼠（Cds2f/f;AlbCre小鼠）。H&E和油红O染色显示，Cds2f/f;AlbCre小鼠在5周龄时表现出肝重比增加和肝脏脂肪变性增加。此外，通过脂质组学分析和13C棕榈酸示踪分析显示，Cds2的缺乏导致脂肪酸流向中性脂质TAG的通量增加。

肝脏Cds2缺乏导致肝脏脂肪变性

进一步分析Cds2f/f;AlbCre小鼠的肝脏显示，5周龄Cds2f/f;AlbCre小鼠肝脏切片中伴有脂肪变性的小叶炎症。血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平升高。与对照组小鼠相比，Cds2f/f;AlbCre小鼠肝脏促炎基因的表达增加，纤维化明显增强，其肝脏切片细胞死亡（对照组小鼠没有）。此外，1岁雄性Cds2f/f;AlbCre小鼠出现肝脏肿瘤，对照组小鼠未观察到。这些数据表明，肝脏Cds2缺乏会导致肝脏炎症、纤维化、细胞死亡和肝脏肿瘤。

肝脏Cds2缺乏导致肝脏炎症和纤维化

接下来，研究人员进行了RNAseq分析，以进一步了解肝Cds2缺乏导致肝损伤的机制。Cds2f/f;AlbCre和对照组小鼠之间改变最显著的途径与线粒体内膜、氧化磷酸化、TCA循环和呼吸电子传递有关。这表明肝线粒体在体内受到Cds2缺乏的影响。线粒体DNA评估显示，与对照组小鼠相比，Cds2f/f;AlbCre小鼠的肝脏线粒体DNA含量降低了约40%。此外，Cds2f/f;AlbCre小鼠呼吸链复合体中的蛋白质水平、线粒体复合物I和II的活性也降低了。

线粒体是高度动态的细胞器，不断发生裂变和融合。对线粒体相关动力蛋白表达的分析显示，Cds2缺陷时线粒体融合缺陷，而裂变没有受到影响。与线粒体融合减少一致的是，电子显微镜（EM）分析显示，与对照组小鼠相比，Cds2f/f;AlbCre小鼠肝脏切片的线粒体面积减少。Cds2f/f;AlbCre小鼠线粒体呼吸受损，脂肪酸氧化（FAO）的基因显著下调，表明FAO受损。使用[3H]标记的棕榈酸酯直接测量FAO表明，Cds2f/f;AlbCre小鼠肝脏中的棕榈酸酯氧化显著降低。这些结果提供了肝Cds2在体内调节线粒体含量、功能和动力学的证据。

线粒体功能受损和FAO基因下调使得研究人员进一步探索改善线粒体功能是否可以缓解Cds2f/f;AlbCre小鼠的NASH样表型。非诺贝特（fenofibrate）是一种PPARα激动剂，已知可增加线粒体生物发生并增强FAO。非诺贝特D 治疗结果表明，PPARα活化减轻了肝脏Cds2缺乏诱导的NASH样表型。

Cds2影响线粒体含量和呼吸复合物的活性和动力学

随后，研究人员探究了Cds2缺失如何影响线粒体形态和功能。研究人员使用顺序离心分离技术检测了CDS2蛋白的亚细胞定位。与之前的研究结果一致，在ER中检测到CDS2蛋白，但在纯线粒体中检测不到。有趣的是，CDS2存在于MAMs部分，该部分由紧密相连的ER和线粒体膜组成，这些膜具有多种脂质生物合成酶活性。MAMs对于PS从ER转移到线粒体至关重要，PS通过线粒体PISD转化为PE。Cds2f/f;AlbCre小鼠线粒体中总PE和最丰富的PE，PE38:4的水平显着降低。EM分析显示，Cds2f/f;AlbCre小鼠肝细胞内质网与线粒体之间的距离增加。这些结果表明CDS2在MAMs中富集，并调节线粒体磷脂组成。

CDS2在MAMs中富集，CDS2缺乏影响MAM蛋白和线粒体磷脂组成

由于线粒体PE对线粒体功能至关重要，在Cds2f/f;AlbCre小鼠中线粒体PE水平降低，研究人员接着探究通过过表达Pisd提高线粒体PE水平是否可以改善Cds2缺陷引起的线粒体缺陷。结果表明，Pisd过表达降低了肝脏甘油三酯、血浆ALT和AST水平，并降低了促炎基因和纤维化基因的表达。与对照组相比，Pisd过表达Cds2f/f;AlbCre小鼠的肝脏脂肪变性和纤维化减少，肝脏中的FAO增强，挽救了CDS2敲减(CDS2 kd)肝细胞的线粒体片段化和耗氧率（OCR）的降低，说明过表达Pisd可改善CDS2缺失引起的肝细胞线粒体缺陷。这些结果提示Pisd在肝脏过表达可改善Cds2f/f;AlbCre小鼠线粒体功能，缓解NASH样表型。

最后，研究人员探究了Cds2过度表达是否能够预防HFD诱导的脂肪肝和肥胖。发现Cds2的过度表达能减弱体重的增加，降低血浆总胆固醇和肝脏TAG的水平，改善HFD诱导的肝脏脂肪变性和肝脏炎症并降低了ALT和AST水平。此外，Cds2的过度表达增加了线粒体的数量以及线粒体中的PC和PE水平。这些数据表明肝脏Cds2过度表达可预防HFD诱导的肥胖和脂肪肝。

Pisd的过表达减轻了Cds2f/f;AlbCre小鼠的NASH样表型

综上所述，该研究表明，CDS2在遗传和饮食诱导的NAFLD小鼠模型中下调。肝脏Cds2缺乏导致肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。从机制上讲，Cds2 缺乏会损害线粒体的形态、脂质组成和功能。通过过度表达Pisd增加线粒体PE合成可减轻Cds2f/f;AlbCre小鼠的NASH 样表型。Cds2 的过表达可防止 HFD 诱导的肥胖和脂肪肝。本研究为 Cds2 在维持线粒体形态、脂质组成和功能中的作用提供了证据，并提供了一个不需要二次饮食或化学肝毒性损伤的体内模型，以获得从脂肪变性到 NASH和纤维化转变的机制见解。

Cds2缺乏如何促进NASH发展的模型




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